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猪瘟病毒(CSFV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

更新时间:2022-04-20      点击次数:2031

【产品名称】

商品名称:猪瘟病毒(CSFV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name :Classical Swine Fever Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起猪的以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为 主要特征的一种高度接触性、致死性的传染病[1],主要通过呼吸道和消化道传染,传播速度快, 发病率和病死 率高,给养猪业带来了巨大的经济损失[2],被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病,被我 国农业部列为一类动物疫病,是危害我国养猪业最严重的动物疫病之一。 本试剂盒适用于检测的扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织、全血等标本中猪瘟病毒 RNA, 适用于猪瘟病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】 本试剂盒用一对猪瘟病毒特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪瘟病毒 RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】 包装规格 50T/盒 CSFV 反应液 500μL×2 管 酶液 50μL×1 管 CSFV 阳性质控品 50μL ×1 管 阴性质控品 250μL ×1 管 说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】 -20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。 【适用仪器】 ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】 病死或扑杀的猪,取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织;待检活猪,用注射器取血 5mL。

【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】 

1. 样品处理(样本处理区)

1.1 样本前处理 每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生 理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离 心管中;全血样品待血凝后取血清 100μL,置 1.5mL 离心管中。

1.1 核酸提取 推荐采用和记怡情娱乐官网(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照 试剂说明书进行操作。

2. 试剂配制(试剂准备区) 根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管 数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表: 试剂 CSFV 反应液 酶液 用量 20μL 1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21μL/管。

3. 加样(样本处理区) 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短 暂离心。

4. PCR 扩增(核酸扩增区) 4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内; 4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光, 选择 None 即可。 4.3 推荐循环参数设置: 步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号 1 1 cycle 42℃ 20min 否 2 1 cycle 95℃ 10min 否 3 40 cycles 94℃ 15sec 否 55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定 5.1 结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像 调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2 结果判断 阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线; 可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 3538 或无 Ct 值。

6. 质控标准 阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示; 阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7. 检测方法的局限性 1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关; 2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果; 3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果; 4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果; 5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果; 6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果; 7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】 1.所有操作严格按照说明书进行; 2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,*混匀并短暂离心; 3.反应液应避光保存; 4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧; 5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服; 6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染; 7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器; 8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】 [1] Moennig V, Floegel-Niesmann G, Greiser-Wilke I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever: review of new knowledge [J]. Vet J, 2003, 165(1): 1-2. [2] Backer J A, Brouwer H, Schaik G, et al. Using mortality data for early detection of classical swine fever in the Netherlands [J]. Prev Vet Med, 2011, 99(1): 38-47. [3] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 27540-2011 鉴猪瘟病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法

 

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