【产品名称】
商品名称:黄热病毒(YFV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name :Diagnostic Kit for Yellow Fever Virus RNA(Real-Time RT-PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】 本试剂盒适用于检测的疑似感染病人的静脉血等标本中黄热病毒 RNA,适用于黄热病毒感染的辅助诊断。 其检测结果仅供参考。
【检验原理】 本试剂盒用一对黄热病毒特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光 RT-PCR 技术对黄热病毒 RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
包装规格 | 25T/盒 | 50T/盒 |
YFV 反应液 | 500μL×1 管 | 500μL×2 管 |
酶液 | 25μL×1 管 | 50μL×1 管 |
YFV 阳性质控品 | 50μL ×1 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 | 250μL ×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 疑似感染病人的静脉血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运 输,严禁反复冻融。
【使用方法】 1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理 按 RNA 提取试剂盒说明书进行提取
1.2 核酸提取 推荐采用和记怡情娱乐官网(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提 取,请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区) 根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管 数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | YFV 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内; 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25ul;荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,请勿选择 ROX 参比荧光。
4.2 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
40 cycles | 55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析 后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2 结果判断 阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线; 可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性; 阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准 阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示; 阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性 1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关; 2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果; 3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果; 4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果; 5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果; 6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果; 7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】 1.所有操作严格按照说明书进行; 2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,*混匀并短暂离心; 3.反应液应避光保存; 4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧; 5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服; 6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染; 7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器; 8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。