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【产品名称】
商品名： 猪蓝耳病毒经典型/猪蓝耳病毒 NADC30 株(PRRSV-C/PRRSV-NADC30)核酸检测试剂盒(双重荧光PCR 法)
Name ： Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome classical type and NADC30 type Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS)，又称蓝耳病，是由猪繁殖 与呼吸综合征病毒引起猪的高度接触性传染病，是影响世界养猪业健康发展的重要传染病之一。 本试剂盒适用于检测猪扁桃体、脑组织、血液等标本中的猪蓝耳病毒经典型和猪蓝耳病毒 NADC30 株， 适用于这 2 种病原感染的辅助诊断及流行病学调查。
【检验原理】 本试剂盒分别根据猪蓝耳病毒经典型和猪蓝耳病毒 NADC30 株基因保守区设计特异性引物和探针，用一 步法荧光 RT-PCR 技术对这 2 种病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
| 包装规格 | 50T/盒 |
| PRRSV-C/-NADC30反应液 | 500μL×2 管 |
| 酶液 | 50μL×1 管 |
| PRRSV-C/-NADC30 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
| 阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 9 个月。
【适用仪器】 ABI 系列 、安捷伦 MX3000P/3005P、Bio-Rad CFX96 等荧光定量 PCR 仪。
【标本采集】 病死或扑杀猪，取扁桃体和脑组织；待检活猪，用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
【保存和运输】 上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运 输，严禁反复冻融。
【使用方法】 1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理 取组织样品约 1g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中， 8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；血液样品取血清 100μL 提取。
1.2 核酸提取 推荐采用和记怡情娱乐官网（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按 照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应 管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | PRRSV-C/-NADC30 反应液 | 酶液 |
| 用量 | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。
3. 加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
| 1 | 1cycle | 42℃ | 20min | 否 |
| 2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
| 3 | 40 cycle | 94℃ | 15sec | 否 |
| 55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定 设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图 像调节 Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范围内调节）、stop 值（一般可在 5~20 范围内调节），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖动阈值线至高于阴性对照），重新分析结果。
5.2 结果判断 FAM 通道为猪蓝耳病毒经典型检测结果，CY5 通道为猪蓝耳病毒 NADC30 株检测结果 阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线； 可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性； 阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准 阴性质控品：Ct 值>38 或无 Ct 值； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性 1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.所有操作严格按照说明书进行；
2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；
3.反应液应避光保存；
4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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