使用方法
一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本 产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头, 下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的是 PC(样品制备阳 性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作 为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加)
成分/每管 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管(1-6 管) |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
榛子源性成分探针法 qPCR 引物-探针混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
N+2 个待测 DNA 模板 | 7 μL | ||
超纯水 | 7 μL | ||
第 6 步所得标准曲线样品稀释液 (1-6 号) | 7 μL(1 号样到 1 号管,2 号样到 2 号管…) |
11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反应 (45 个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 60 sec(采集 FAM 通道的荧 光信号) |