产品及特点:
诺如病毒(Norwalk Virus)是单股正链 RNA 病毒,属于人类杯状病毒属,是一种引起非细菌性急性肠胃炎的病毒,如诺病毒感染性强,以肠道传播为主,通过口-粪传播,以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传播载体。诺如病毒可分为 G I-G 五个基因群,其中引起人类感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速灵敏诊断具有重要意义。为此本公司开发了本产品,采用RT-PCR 技术检测疑似感染动物血清或组织中的诺如病毒 G1 型。它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。
2. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
3. 产品精心优化且特异性高,引物是根据诺如病毒 G1 型RNA高度保守区设计,不会跟除此之外的其它病毒RNA发生交叉反应。
4. RT-PCR mix 中含上样染料,扩增反应后可以直接上样电泳。
5. 本产品足够50次20μL体系的PCR反应。
6. 本产品只能用于定性实验,不能用于定量。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分:
成 份 |
A |
B |
C |
D |
E |
使用手册 |
注:为避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供专一的核酸片段作为阳性对照。
运输及保存:
低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。
自备试剂:样品RNA
使用方法:
一、样品DNA的制备
1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取反应,多出的两个中一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL诺如病毒 G1 型PCR阳性对照(1×10E6拷贝/μL,本试剂盒提供)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
2. 用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。
二、设置PCR反应(20μL体系)
3. 标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的DNA样品,额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照,另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分:
成分/每管 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照 | PCR阳性对照 |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
制备的N+2个DNA样品 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
E | - | - | 7 μL |
B | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
4. 上机进行PCR,PCR反应参数为:
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 20 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR反应 (45个循环) | 95℃ | 30 sec |
55℃ | 60 sec | |
72℃ | 60 sec | |
延伸 | 72℃ | 7 min |
三、电泳分析
5. 取5-10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳,检测扩增效果,由于扩增产物较短,建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。
6. 阳性样品预期得到的扩增产物长度为220bp左右。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或PCR阴性对照)有此扩增产物,说明环境污染,则整个实验无效,不需要分析实验结果。
7. 如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物,则说明有系统性的问题(试剂、设备、程序、操作等),需要重复并排查原因。
8. 如果没有上述两种情况,则实验有效,可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中有扩增产物的判定为阳性,无则判定为阴性。