辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书
微量法100管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值;而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。
需自备的仪器和用品:
酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
酸性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
碱性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体10 mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:液体3 mL×1瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1瓶,-20 ℃保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1瓶,4 ℃保存,用时加入3mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4℃保存一周;
试剂五:液体3.6mL×1瓶,4 ℃保存;
试剂六:液体30mL×1瓶,4 ℃保存;
试剂七:液体50mL×1瓶,4 ℃保存。
NAD+和NADH的提取:
1 血清(浆)中NAD+和NADH的提取:
NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,
置冰上待测。
2组织中NAD+和NADH的提取:
NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3 细胞或细菌中NAD+和NADH的提取:
NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
NADH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):
试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
样本 | 20 | 20 |
试剂一 | 80 | 80 |
试剂二 | 30 | 30 |
试剂三 | 30 | 30 |
试剂四 | 30 | 30 |
试剂五 | 30 | 30 |
试剂六 | 200 | 混匀,室温避光静置20min |
试剂六 | 200 |
充分混匀,静置5min后,20000g,25℃离心5min,弃上清,沉淀中加入:
试剂七 | 400 | 400 |
混匀,取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2,计算△A=A2-A1。
注意事项:
1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管
加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若NAD+测定中△A(A2-A1)≤0.0302,NADH测定中△A(A2-A1)≤0.0222,说明样本中辅酶含量较低,已低于检测限,可做如下调整:(1)将测定管避光静置时间20min延长到60min;(2)在提取阶段增加取样量,即取0.2g样本或0.2mL样本加入1mL提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒100管保证测48个NAD+或NADH.
NAD+和NADH含量的计算:
(一) NAD+含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中y为△A,x为NAD+浓度nmol/mL
1、血清(浆)中NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)
2、组织、细菌或细胞中NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD+ (nmol/g 鲜重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+ (nmol/104 cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)
(二)NADH含量的计算
标准条件下的回归曲线为y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976;其中y为△A,x为NADH浓度nmol/mL
1、血清(浆)中NADH含量计算
NADH含量(nmol/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)
2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
注 意:最di检测限为0.1nmol/mL或0.1nmol/g鲜重 或0.001nmol/mg prot