鱼类神经坏死病毒(VNN)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
【产品名称】
商品名称:鱼类神经坏死病毒(VNN)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)
Name :Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
鱼病毒性神经坏死病又称为病毒性脑病和视网膜病,是一种严重危害鱼类鱼苗的病毒性疾病。病原为病毒性神经坏死病毒(Viral nervous necrosis virus, VNNV),属乙型野田村病毒属成员[1]。其临床症状为一系列与神经有关的异常表现。鱼苗具不正常的螺旋状或旋转式游动或静止时腹部朝上,一旦用手触碰病鱼,病鱼会立即游动等现象,鱼体体色异常苍白。不同种类的鱼临床症状不同,有的鱼苗会出现鳔过度膨胀,有的病鱼厌食、消瘦等。发病严重的鱼苗伴随着ji高的死亡率[1-2]。
本试剂盒适用于检测的鱼的脑、眼等标本中鱼类神经坏死病毒 RNA,适用于鱼类神经坏死病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒对鱼类神经坏死病毒基因设计特异性的引物和探针[2-3],用一步法荧光 RT-PCR 技术对鱼类神经坏死病毒RNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
VNN 反应液 | 500μL×2 管 |
VNN 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
注:
1) 不同批号试剂不能混用。
2) 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列
荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】
取鱼类的脑和眼,鱼苗和较小的仔鱼取整条鱼。
【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标
本运送应采用 2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中, 8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2 RNA 提取
推荐采用和记怡情娱乐官网(上海)生命科学有限公司生产的 RNA 提取试剂盒(离心柱提取法),
请按照试剂盒说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | VNN 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择:
检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤ 38,且曲线有明显的增长曲线,判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
6. 质控标准
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7. 检测方法的局限性
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
Ø 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
Ø 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
Ø 所有操作严格按照说明书进行;
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,wan全混匀并短暂离心;
Ø 反应液应避光保存;
Ø 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全 通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 陈爱平, 江育林, 钱冬, 等. 病毒性神经坏死病[J]. 中国水产, 2010.
[2] 中国农业部. SC/T 7216-2012 鱼类病毒性神经坏死病(VNN)诊断技术规程[S]. [3]罗卫. 鱼类病毒性神经坏死病的病原学研究及检测方法的建立[J]. 华中农业大学, 2007.