脯氨酸（PRO）含量测定试剂盒说明书

                                         微量法100管/96样

注  意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Pro广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro含量显著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

测定原理：

用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：冰乙酸25 mL×1瓶， 4℃保存。（自备）

试剂二：液体25 mL×1瓶， 4℃保存。

试剂三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自备）

样品测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。

2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），充分混匀，之后置90℃浴振荡提取10分钟，10000g，25℃离心10分钟，取上清，冷却后待测。

测定步骤：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。

2、   样本测定：

(1) 取0.25mL样本+0.25mL试剂一+0.25mL试剂二 于有盖EP管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。

(2) 待冷却后，加入0.5mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.2mL上层溶液于微量石英比色皿或96孔板中，于520nm波长处比色，记录吸光值A。

Pro含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、典型回归方程y = 0.0521x - 0.0021  (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、典型回归方程y = 0.02605x - 0.0021  (x为脯氨酸含量，μg/mL；y为吸光值A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro含量(µg/g鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意：Z低检测限为1μg/mL。