羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。

测定原理：

样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯jia醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。

自备实验用品及仪器：

天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H₂O（V/V）= 1:1，室温保存。

细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

羟脯氨酸提取：

1.        组织：称取约0.2g样品于玻璃管，加入2mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，离心20min，取上清待测。

2.        细胞：取约500万个细胞，加入1mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。

3.        血清游离羟脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.2mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。

测定操作表：

1、   分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至560nm，蒸馏水调零。

2、   操作表

羟脯氨酸含量计算公式：

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R²=0.9991

（1）按样品重量计算

组织羟脯氨酸含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)

                        = 0.154×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按细菌或细胞密度计算

细胞羟脯氨酸含量（mg/10⁴ cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 细胞数量（万个）

（3）按血清体积计算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样×2

                 =0.154×（ΔA-0.0251）

V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=32.4375x+ 0.0251，R²=0.9991

（1）按样品重量计算

HYP含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷(V样÷V样总×W)

                = 0.308×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按细菌或细胞密度计算

HYP含量（mg/10⁴ cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷细胞数量（万个）

（3）按血清体积计算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×2

                 = 0.308×（ΔA-0.0251）

V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g；2，血清吹干后复溶的倍数。

注意事项：

1、   吸光值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、   试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

3、   Z低检出限为3.8mg/L。