一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量测定试剂盒说明书

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

NO（Nitric Oxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。

测定原理：

NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂^—，在酸性条件下，NO₂^—与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。(用之前60℃加热震荡15min)

样品处理：

1.        组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。

3.        体液和培养液等其它液态样品：直接测定。

测定步骤和操作表：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。

2、   操作表

NO含量计算：

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.016x -0.0103，R²= 0. 9986

1、组织样品：

（1）按样本质量计算

NO含量（μmoL/g 鲜重）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反总÷（V样÷V样总×W）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO含量（μmoL/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反总÷（V样×Cpr）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷Cpr

2、细胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）×10^-3

= 0.125×（ΔA +0.0103）÷细胞数量（万个）

3、其他样品：

NO含量（μmoL/L）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反总÷V样                  

= 125×（ΔA +0.0103）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL

b.       用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y= 0.008x - 0.0103，R²= 0. 9986

1、组织样品：

（1）按样本重量计算

NO含量（μmoL/g 鲜重）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反总÷（V样÷V样总×W）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

NO含量（μmoL/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反总÷（V样×Cpr）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷ Cpr

2、细胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）×10^-3

= 0.25×（ΔA +0.0103）÷细胞数量（万个）

3、   其他样品：

NO含量（μmoL/L）=（ΔA +0.0103）÷0.008× V反总÷V样= 250×（ΔA +0.0103）

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL