谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书

                                        微量法100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

测定原理：

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、酶标仪、96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：

试剂一×2瓶，60 mL，4 ℃保存；

试剂二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

试剂三×1瓶，60 mL，常温保存；

试剂四×1瓶，5 mL，常温保存；

试剂五×1瓶，3 mL，常温保存；

试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm。

2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：

混匀，37℃水浴1 小时

混匀，8000 g，25℃离心10 min；取上清液，在96孔板中加入下列试剂

混匀，室温静置15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意：

1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。

2、ΔA（A测定管-A对照管）若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间1h延长到2h，相应的在计算公式中除以2。

酶活性计算：

标准条件下测定的回归方程为y = 1.9244x + 0.0057，R² = 0.9983；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值A。

1、血清（浆）GLS活性

单位定义：每mL血清（浆）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol /min /mL)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反总÷V样÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、组织、细菌或细胞GLS活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg蛋白质每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

GLS(nmol/min /g 鲜重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每1万个细菌或细胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(nmol/min/10⁴ cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(500×V样÷V样总) ÷T ×1000       =0.7274×(ΔA -0.0057)

V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V反总：反应体系总体积，1.05mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万; 1000，μmol到nmol换算系数。