焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）试剂盒说明书

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一种胞质酶，广泛存在于植物组织中，催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化，在光合作用碳代谢中起重要作用。

测定原理：

PFP催化6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖，它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸，340nm处的吸光度变化反映了PFP的活性的高低。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体1mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂五：液体1mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂六：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取：

1.        组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

2.        细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

3.        液体：直接检测。

测定操作：

1.        紫外分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.        取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL试剂一，20μL试剂二，20μL试剂三，10μL试剂四，10μL

试剂五，20μL试剂六，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A1-A2

计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

= 643.08×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T= 643.08×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g