土壤碱性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书

                                                     微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：                           

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。

测定原理：

碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。

自备仪器和用品：

可见光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、无水乙醇和甲苯。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加576μL无水乙醇（自备），24μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用）

标准品：液体×1瓶，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。

催化反应：

称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加400μL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。

显色反应：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A空白管。

3. 标准管：微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A标准管。

4. 测定管：微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

S-ALP活性计算公式：                                                                                                                             

活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放1μmol酚为1个酶活单位。

S-AKP/ALP（μmol/d/g 土样）=[C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W÷T

= 0.725×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷W

C标准液：0.5μmol/mL；V总：催化体系总体积，1.45mL；W：土壤样品质量，g；T：催化反应时间，24 h=1 d。