还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）试剂盒说明书

 微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

测定原理：

DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度与GSH含量成正比。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体：直接测定。

GSH测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A1。

4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A2。

注意：空白管只需要测定一次。

GSH含量计算公式：

GSH标准曲线公式：y=1.5 x（x为GSH浓度，μ mol /mL；y为吸光值）

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷（V样×Cpr） =0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3）按细胞数量计算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=0.667×(A2－A1) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷V样 =0.667×(A2－A1)

V反总：反应总体积，0.2mL；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量

b.使用96孔板测定的计算公式如下

GSH标准曲线公式：y=0.75x（x为GSH浓度，μ mol /mL；y为吸光值）

（1）按蛋白浓度计算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷V样÷Cpr =1.334×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×W)=1.334×(A2－A1) ÷W

（3）按细胞数量计算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=1.334×(A2－A1) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷0.75×V反总÷V样 =1.334×(A2－A1)

V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1.        试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

2.        Z低检出限为0.011mmol/L。