锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）试剂盒说明书

微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

锰过氧化物酶（EC1.11.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT，多环芳烃等。

测定原理：

锰过氧化物酶在Mn2+存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：

试剂一：液体110mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体2mL×1支，4℃保存。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体2mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

1.        组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2.        细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3.        培养液或其它液体：直接检测。

测定操作：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至465nm，蒸馏水调零。

2、  测定前将试剂一、二、三、四在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min以上。

3、  样本测定表

在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录465nm下30s时的吸光值A1和2min30s后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min以上，测定时加入20µL样本和180µL混合液测定。

酶活计算公式：

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×W÷V样总）÷T= 413×ΔA÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 413×ΔA÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T= 413×ΔA

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，2×10-4 L；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min

b.       用96孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/mg prot）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×W÷V样总）÷T= 826×ΔA÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109] ÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 826×ΔA÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP活性（nmol/min/mL）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T= 826×ΔA

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应总体积，2×10-4 L；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min