线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书

                                          微量法100管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理：

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：80mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：2 mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五：8mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入4mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①        准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②        将匀浆600g，4℃离心5min。

③        弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④        上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。

⑤        步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

测定步骤：

1、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min

混匀，4000g，25℃离心10min，取上清液

2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂）

混匀，室温静置10min后，在 660nm处读取A测定管和A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

复合体Ⅴ活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 1.274x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

 复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×10⁶]÷(V样×Cpr) ÷T

                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

 复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×10⁶]÷(W× V样÷V样总) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /10⁴ cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反总×10⁶]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反总：反应体系总体积，1.2×10^-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 0.637x + 0.004；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

 复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反总×10⁶]÷(V样×Cpr) ÷T

 =125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

 复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×10⁶]÷(W× V样÷V样总) ÷T

                         =101.5× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /10⁴ cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反总×10⁶]÷(500×V样÷V样总) ÷T

                         =0.203× (ΔA-0.004)

V反总：反应体系总体积，1.2×10^-4 L； V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。