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禽腺病毒 C 种 4 型(FADV-C-4) 核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)说明书

发布时间:2024/10/14      点击次数:286

禽腺病毒 C 种 4 型(FADV-C-4) 核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

【产品名称】

商品名称:禽腺病毒 C 种 4 型(FADV-C-4)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法) Name :Avian adenovirus C type 4 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

禽腺病毒 C 种 4 型(Avian adenovirus C type 4 , FADV-C-4)属于腺病毒科禽腺病毒属,为双链 DNA 病毒,分为 3 个群。自 2013 年,国内鸡群由禽腺病毒(FADV)引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多[1]。而到 2015 年,高致病性血清4型 FADV 引起的肝炎-心包积综合症已在国内鸡群爆发,对养禽业的发展构成严重威胁[2-3]。

本试剂盒适用于检测的禽类动物肺、脾、脑等组织、呼吸道分泌物、全血等标本中禽腺病毒 C 种 4 型 DNA, 适用于禽腺病毒 C 种 4 型感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒用一对禽腺病毒 C 种 4 型特异性引物,结合一条特异性荧光探针,用一步法荧光PCR 技术对禽腺病毒 C 种 4 型病毒 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

包装规格25T/盒50T/盒

FADV-C-4 反应液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

FADV-C-4 阳性质控品50μL ×1 管50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管250μL ×1 管

注:

1)不同批号试剂不能混用。

2)试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀禽,取肺、脾、脑等组织;待检活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物,放于 1mL50%甘油生理盐水中;用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;全血样品待血凝后取血清 100μL,置于 1.5mL 离心管中。 

1.2核酸提取

推荐采用和记怡情娱乐官网(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按    照试剂说明书进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂NDV 反应液酶液

用量20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,

短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min

240 cycles94℃15sec

55℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;

可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;

阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]赵继勋.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病学探究与防控认识[J]. 北方牧业, 2017(6): 18.

[2]楚电峰, 刘相娥, 薄智勇, 等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病学和防控研究现状[J]. 中国动物检疫, 2017,34(5): 86-89.

[3]王亚楠, 韩涛, 李纯玲, 等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究现状[J]. 中国动物保健, 2017, 19(1): 61-64.


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