【产品名称】

商品名称：猪圆环病毒通用型 （PCV-U）核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）

Name：Porcine Circovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

猪圆环病是由猪圆环病毒（Porcine Circovirus）引起猪的一种传染性、先天性颤抖和断奶仔猪多系统功能障碍性疾病。该病毒具有 PCV1 和 PCV2 两种血清型，PCV1 无致病性。受 PCV2 感染的断奶仔猪出现呼吸急促、困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变及进行性消瘦。

本试剂盒适用于检测肺、淋巴结组织、全血等样本中的猪圆环病毒通用型，用于猪圆环病毒通用型感染的辅   助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对猪圆环病毒基因保守区设计特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术对猪圆环病毒通用型的 DNA 进行体外扩增检测，用于科研上对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

PCV-U 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PCV-U 阳性质控品 1.49×10^8拷贝/mL50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃避光保存，有效期 12 个月。避免反复冻融，冻融次数不超过 5 次；生产日期和失效日期见标签。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

组织样品采集：采取病死猪（包括流产的死胎）)或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏） 装入灭菌 15 mL 离心管中，编号，送实验室。血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5 ml，置于无菌离心管内，室温或者 37℃倾斜放置自然凝集 20 min ~30 min，2 000 r/min~3 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液到新的离心管内备用。精液样品采集：按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。粪便样品采集：取猪新鲜粪便 1 g，装入 15 mI 灭菌离心管中，加入 5 mL PBS，混匀。细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后，将细胞培养物置于 1.5 mL 无 DNA 酶的灭菌离心管内，编号备用。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：取 1 g 解冻的组织，剪碎，加入 2 mL PBS 进行研磨，制备组织匀浆，8000 r/min 离心 5 min，取上清用于后续的核酸提取。血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。粪便样品：3000 r/min 离心 10 min，取上清液，转入 1.5 mL 离心管中，用于后续的核酸提取。细胞培养物：4000 r/min，4℃离心 l0 min，取上清用于后续的核酸提取。

1.2核酸提取

推荐采用和记怡情娱乐官网（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明    书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂PCV-U 反应液酶液

用量（样本数为 N）19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL 管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX

参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例）

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数器，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 35901-2018  猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测方法[S].