【产品名称】

通用名称：转基因大豆MON87708品系核酸检测试剂盒 (荧光-PCR 法)

Name ：Diagnostic Kit for MON87708 Gene DNA (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

转基因大豆MON87708品系核酸检测试剂盒适用于检测转基因植物的 MON87708 基因，用于筛查待检测植物中是否含有 MON87708 成分。其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用国家标准的 MON87708 特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，反复冻融不能超过 5 次。有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

称取 200g 样品。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃冰壶。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1  样本前处理

固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。

1.2  DNA 提取

对于固体标本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推荐的方法：

1)  每个样品取 2 个平行管。称取 200mg 粉碎的样品，加入 1mL 预冷至 4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静止 5min，4℃条件下 10000g 离心 15min，弃上清液；

2)  加入 600uL 预热至 65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在 65℃恒温保持 40min，期间颠倒混匀 5 次；

3)  室温条件下10000g 离心10min，取上清液转移至新离心管中，加入5uLRNAseA， 37℃恒温 30min，分别用等体积苯/酚：异戊醇溶液和三氯jia烷：异戊醇溶液各抽提一次；

4)  室温条件下，10000g 离心 10min，取上清液至新离心管，加入三分之二体积的异丙醇，十分之一体积的 3mol/L 的乙酸钠溶液（pH=6.5），-20℃放置 2-3h；

5)  在 4℃条件下，10000g 离心 15min，弃上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；

6)  加入 50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即为样品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA/提取试剂盒。

油脂样本请直接选用市售油脂 DNA/提取试剂盒，按说明操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1   将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2   设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择： 检测通道

（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，请勿选择ROX 参比荧光。

4.3   推荐循环参数设置：

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2  结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。