中文名称：荧光定量RT-PCR试剂盒（两步法）

英文名称：Two-Step qRT-PCR Kit

规格及成分

荧光定量RT-PCR试剂盒（两步法）低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂

样品 RNA、PCR 引物、ROX 染料

荧光定量 RT-PCR 试剂盒（两步法） 特点：

1.    即开即用，足够 50 次 RT 反应（10uL 体系）和 50 次 qPCR 反应（20 uL 体系）。

2.    RT 和 PCR 分开进行，方便优化 RT 和 qPCR 条件，也方便一个 RT 反应用于多个不同引物的 qPCR 扩增。

3.    RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分，简化了反应设置步骤。

4.    qPCR mix 是 2×预配液，也简化了反应设置步骤。

5.    qPCR mix 含 qPCR 染料，无需另外加入相关荧光 PCR 染料。

6.    扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。

7.    提供定量 PCR 专用模板稀释液，保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。

使用方法

一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）

1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。

2、如果需要用 RNA 制备标准曲线，则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 RNA 样品稀释不同梯度，并分别作为下步 RT 反应的模板。

3、由于污染的 gDNA 会严重影响 RNA 的定量，因必须che底去除 RNA 样品中的gDNA 污染。用户可以另购 RNase-free DNase 来消化 RNA 样品，也可以合成只识别外显子的引物。

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反应体系（10 uL 体系），在每个管中加入下列成分:

5、42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

6、85℃保温 5 秒以终止反应，然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作为下步 qPCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在

-20℃长期保存。如果需要用 cDNA 制备标准曲线，则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 cDNA 样品稀释不同梯度，并分别作为下步qPCR 反应的模板。

三、qPCR（20 uL 体系）

8、在每个 PCR 管中加入下列成分：

注意：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器，则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900，ROX 的最佳浓度为 1×（即在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX）。对 ABI 7500， ROX 的最佳浓度为 0.05-0.1×（每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可将 10×ROX 稀释到

1×，然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye"中的“ROX"选项取消打勾，然后重新分析数据。

对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000， RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光PCR 仪器，ROX 不是必须的但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

9、PCR 反应参数(需要用户根据模板和引物决定，下面参数的只做参考)：

10、 实验结果分析：反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，制作标准曲线。具体方法

随仪器不同而不同，请参考 qPCR 仪器手册。

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