两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）说明书

中文名称：两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）

英文名称：Two-Tube  RT-PCR Kit（AMV-Taq）

本试剂盒是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。

规格及成分：

RT试剂盒成分表：

即用型 PCR 试剂盒成分表：

两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）具有以下特点：

1.即开即用，足够 50 次 RT 反应（20 uL 体系）和 600 次PCR 反应（30 uL 体系）。

2.cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。

3.PCR 试剂盒具有即用、简单等优点，PCR mix 中含上样染料，所以 PCR 产物可以直接上样电泳。

4. 两管式操作，RT 和PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或PCR 反应条件。

5.扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。

运输及保存

低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂

样品 RNA、模板专一正向和反向引物。

使用方法：

一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）

可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA

1.按下表配制 RT 反应体系（20 uL 体系）:

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非mRNA 的干扰。

2.70℃保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。

3.按顺序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。

4.42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

5.70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。

6.合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在-20℃长期保存。

三、PCR（30 uL 体系）

1、将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中，轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加专用染料，但在 PCR 结束后，电泳上样前，则需要加入电泳上样液，否则电泳时没法判断电泳速度。

2、在 PCR 管中加入下列成分：

注意：cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍wan全取决于靶基因的丰度。

PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

四、电泳检测

1、取 5-0 uL PCR 产物直接在PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要

额外再加电泳上样液。

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