人胆囊上皮细胞永生化+GFP

细胞特性：

1) 细胞来源于人胆囊组织。

2) 细胞鉴定：细胞角蛋白19（CK-19）免疫荧光染色为阳性。

3) 经鉴定细胞纯度高于90%。

4) 不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5) 细胞生长方式：上皮样，多角形细胞，贴壁培养。

细胞筛选

该细胞为已经构建好稳定转染GFP的细胞，随细胞传代次数的增加，其GFP荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度，可以加入嘌呤霉素进行再次筛选。建议收到细胞后至少传3代，冻存留种后再进行筛选。

初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度为1ug/ml嘌呤霉素的完培维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2ug/ml嘌呤霉素的完培继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5ug/ml。若筛选过程中，漂浮细胞大于60%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/ml嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完培正常培养。

运输和保存：

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与和记怡情娱乐官网联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的注意事项：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系和记怡情娱乐官网。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完培6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完培来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

培养基及培养冻存条件准备：

1) 和记怡情娱乐官网推荐使用人胆囊上皮细胞永生化细胞专用培养基作为体外培养人胆囊上皮细胞的培养基。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完培的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完培重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完培的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

人胆囊上皮细胞永生化+GFP

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