柯萨奇病毒A10型PCR检测试剂盒

产品名称：柯萨奇病毒A10型PCR检测试剂盒

本试剂盒用于体外定性检测人咽/拭子样本中的柯萨奇病毒 A10 型核糖核酸（RNA）。

柯萨奇病毒 A10 型(Coxsackievirus A10，CA10) 为单股正链RNA 病毒，属于人类肠道病毒 A 类。CA10 为人类感染性疾病的一种病原，能引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡炎和脱甲病等。近几年爆发的手足口病中除了主要病原体 EV71 外，还有多种人类肠道病毒参与感染，CA10 为其常见的一种。本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法，对咽/拭子样本中的 CA10 核酸进行定性检测， 检测结果仅供科研，不能单独作为确诊或排除病例的依据。

本试剂盒利用实时荧光 PCR 技术，以 CA10 基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR 扩增对 CA10 RNA 进行定性检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取过程及 PCR 扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。

【试剂组成】

注：不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用； 需自备的试剂：核酸提取/试剂。

阴阳性质控品说明：阳性质控品为含 CA10 目的序列的假病毒溶液，浓度为 1×105copies/mL；阴性质控品为生理盐水。阴阳性质控品在实验中均参与核酸提取。

【储存条件及有效期】

试剂盒保存于-20±5℃，有效期 9 个月；

反复冻融次数不超过 7 次；试剂开瓶后，在 4℃储存温度条件下开瓶次数不超过 7 次；试剂在 4℃条件下连续保存不超过 14 天；试剂在 37℃条件下连续保存不超过 120h；运输采用干冰保持低温，运输时间不应超过 3 天。

试剂盒生产日期及失效期见产品标签。

【适用仪器】

ABI Prism 7300，ABI Prism 7500，Roche LightCycler480，DA7600。

【样本要求】

1.  适用样本类型：咽/拭子。

2.  样本采集：

样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的 5 岁以下的儿童。

采集病人发病 3 日内的咽/拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有 3～5ml 保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在 0～8℃运输和保存。样本应冷冻运输， 运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。

3.  样本保存和运送：样本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为 4 个月；长期保存，请置于-70℃。运送采用 0℃冰壶。

【使用方法】

1.  样本处理和核酸提取（样本处理区）

可采用本公司生产的核酸提取/或纯化试剂（如离心柱法；磁珠法）。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中无说明内标的使用方法，则可按照样本体积：内标溶液体积=50:1 的比例在样本中加入内标溶液后进行核酸提取。

本试剂盒中的阴性质控品和阳性质控品均需要提取，用于对环境进行监控和 PCR 检测试剂的质控。

2.  PCR 试剂准备（试剂准备区）

2.1       大包装规格试剂使用：

从试剂盒中取出 CA10 PCR 反应液 A、CA10 PCR 反应液 B，室温融化后振荡混匀，8,000rpm 离心数秒后使用。取 N 个（N＝待测样本个数+阴性质控品+ CA10 阳性质控品）PCR 反应管，

CA10 单人份扩增体系配制如下表：

将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将 20µL 扩增体系分装到PCR 管中。

2.2        单管单人份规格试剂使用： 直接使用 CA10 PCR 反应管。

3.  加样（样本制备区）

往上述对应的CA10 反应管中分别加入提取后的待测样本核酸、阴性质控品核酸、阳性质控品核酸各 5µL，盖紧管盖，8,000rpm 离心数秒后转移至扩增检测区。

4.  PCR 扩增（扩增检测区）

4.1        将反应管放入仪器样品槽内。

4.2      ABI Prism 7500 仪器设置（ABI Prism 7300 仪器设置参照此操作）

4.2.1 打开“Setup"窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow），并在“Sample Name"一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：NONE，Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference： NONE。

4.2.2  打开instrument窗口，设置循环条件如下： 50℃ 15分钟，1个循环；

95℃ 15分钟，1个循环；

94℃ 15秒→60℃ 45秒（收集荧光），45个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。

4.3     LightCycler480仪器设置

4.3.1  打开软件后，选择“New Experiment"，设置检测模式为“Multi Color Hydrolysis Probe/UPL Probe"，检测通道为FAM， VIC。

4.3.2  设置循环条件：

4.3.3  选择“Sample Editor"，设定样品的名称、类型，在“Standard Concentration"框中输入标准品浓度，设置完成后，保存文件，运行程序。

4.4      DA7600 仪器设置

4.4.1 打开软件后，在设置程序参数界面中，设置扩增程序和温度设置，条件如下：

4.4.2  点击样本参数界面，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（UNK），并在“样本名称"一栏中设置样本名称；探针染料类型选择：FAM 和HEX 。

4.4.3 设置完成后，保存文件，运行程序。

5.  结果分析(请参照各仪器使用说明书进行设置，以 ABI7500 仪器为例)

反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行

调整，Start 值可以在 3～15、End 值可设在 5～20，在 Log 图谱窗口设置 Threshold 的 Value 值，使阈值线位于扩增曲线指数期, 阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analysis 自动获得分析结果，在此基础上，微调阈值线位置使所得标准曲线的R2 值最大即可在“Report"窗口读取检测结果。

6.  质量控制

6.1       阴性质控品：FAM 检测通道无扩增曲线，VIC 检测通道有扩增曲线且 Ct 值＜43。

6.2   阳性质控品：FAM 检测通道有扩增曲线，且 Ct 值＜33；VIC 检测通道有或无扩增曲线。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

7.  结果判断

7.1        内标结果判定：若样品 VIC 通道 Ct＜43，则可判定该样品内标阳性，若 VIC 通道无扩增曲线或 Ct≥43，则可判定该样品内标阴性。

7.2        若检测样品 FAM 检测通道无扩增曲线或 Ct≥43，且该样品内标阳性，可判样品为柯萨奇病毒 A10 型阴性，

7.3       若检测样品 FAM 检测通道有扩增曲线且 Ct≤38，可判样品为柯萨奇病毒 A10 型阳性，

7.4       若检测样品 FAM 检测通道有扩增曲线且 38＜Ct＜43，该样品建议复检，若复检结果 Ct＜43 则可判样品为柯萨奇病毒 A10 型阳性；若复检结果无扩增曲线或 Ct≥43，可判样品为柯萨奇病毒 A10 型阴性。

【阳性判断值或者参考区间】

通过临床样本检测结果分析，利用 ROC 曲线法最终确定本试剂盒的参考区间为 38～43；内标参考值为 43。

【检验结果的解释】

1. FAM 检测通道为阳性时，由于体系的竞争关系，内标可能为阴性。

2. 内标结果为阴性时，若该检测管的 FAM 检测通道也为阴性，说明体系受抑制或操作失误，试验无效，需对该样品进行复检。

3. 每次实验均需检测阴性质控品及阳性质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定；

【检测方法的局限性】

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关；

2. 样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果；

3. 病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果；

4. 由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取/试剂进行样本处理时的核酸提取效率存在一定差异，请使用本产品说明书中检验方法所选用的核酸提取/试剂；

5. 本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段。

【产品性能指标】

1  试剂盒分析性能评估结果显示：

1.1        阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。

1.2        Z低检测限：8.0×102copies/ml。

1.3        精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于 5%。

1.4        分析特异性

1.4.1                     交叉反应：交叉反应验证的柯萨奇病毒 A6 型、柯萨奇病毒 B 组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒 70 型、肠道病毒 71 型、柯萨奇病毒 A24v、埃可病毒 11 型、埃可病毒 30 型、麻疹病毒、风疹病毒、副流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、链球菌、葡萄球菌、肺炎链球菌均为来源于临床的灭活病毒培养物或者细菌培养液，并经 PCR 或测序确认为相应病原体，在本试剂盒的检测条件下，病原体浓度不高于 1.0×105copies/mL 时，检测结果均为阴性，无交叉反应。

1.4.2                     干扰反应：咽/拭子样本可能存在的内源性物质以及可能存在的外源性药物红霉/素（60mg/L）、头孢/克洛（75mg/L）、地塞/米松（0.6mg/L）、利巴/韦林（2mg/L)、干扰素（100 单位/ml）均不影响试剂盒的检测结果。

2  临床试验：与对照方法检测结果对比，本试剂盒检测结果的灵敏度为 100%、特异度为 98.0%、总符合率 98.4%，Kappa 值为 0.952

（p<0.001）。

【注意事项】

1.  本产品仅用于体外检测，实验前请仔细阅读本说明书；

2.为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜；样本的处理应在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和处理均需符合相关法规要求：包括卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》；

3.  产物处理：PCR 结束之后，产物容易引起污染，应由当天不再参与实验的人员将所有反应管放入生物安全垃圾处理袋或其他容器中确认WAN全封闭后方可丢弃；

4.  全程应避免RNA 酶污染，实验过程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。在洁净消毒、紫外光杀菌的化学通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道；

5.  使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无DNA 酶、RNA 酶的离心管和吸头；

6.  PCR 检测试剂使用前要WAN全解冻，8,000rpm 离心数秒后使用，但应避免反复冻融；

7.  如果在样本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性；

实验室管理应严格按照PCR 基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增检测区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

1.  实验完毕用 10%次氯酸或 75%酒精处理工作台和移液器，然后用紫外线灯照射 20-30 分钟； 10.完成样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用(24h 内)；

11. 所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；

12. 须对每次实验进行质量控制。