马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒

产品名称：马流行性感冒病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称：Method of the real-time RT-PCR for the detection of Equine Influenza Virus (50 reactions)

马流感是马、驴和骡的一种急性呼吸道疫病，由正黏病毒科 A 型流感病毒属中的两个 A 型流感病毒亚型引起，分别为H7N7（曾称为马-1 型）和 H3N8（曾称为马-2 型）。禽liu感病毒被认为是两种亚型马流感病毒的祖先，易感马科动物的临诊症状表现为发热、刺耳地干咳和鼻流黏性脓性分泌物。

本试剂盒是依据OIE3.5.7 章马流感诊断国际标准中马流感国际参考实验室推荐的针对M 基因可以同时监测H7N7 和H3N8 等马流感病毒亚型的引物和探针序列，优化反应参数配套生产，探针的 5` 端和 3`端分别标记不同的荧光素，如 5`端标记 FAM 荧光素，3`端是 TAMRA 修饰。

【试剂组成】

3、 样本采集,存放及运输

3.1  样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。

用于检测多种样本（如肌肉、脏器、鼻或咽喉拭子、血清或血浆、组织渗出液等）中马流感病毒的 RNA。

3.2 存放：样品应尽快研磨提取核酸进行检测，-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复冻融。

3.3  运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

4、 荧光 RT-PCR 检测

4.1 操作方法

4.1.1 样本的处理（在样本制备进行）：

4.1.1.1  取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），做标记。(注：试剂盒中的阳性对照吹打混匀后直接作为PCR 检测的模板，无需提取核酸)

4.1.1.2  每管加入 600 mL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 mL，一份样本换用一个吸头，再加入 200 mL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层， 也可以用手颠倒混匀），于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。

4.1.1.3  取与 4.1.1.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 mL 异丙醇（-20℃预冷）， 做标记。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500mL，不能吸出中间层，颠倒混匀。

4.1.1.4  于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 mL 75％ 乙醇，颠倒洗涤。

4.1.1.5  于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。

4.1.1.6   4 000 r/min 离心 10s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。

4.1.1.7   加入 33 mL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。

【推荐使用《《病毒基因组 DNA/RNA 离心柱型提取试剂盒》》，更方便快捷高效提取核酸】。注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置-70 ℃冰箱内。

4.1.2          检测

4.1.2.1 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：

从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物，在室温下融化后，2000 r/min 离心 5 s。设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表 2：

表 2 每个样品测试反应体系配制表

根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15mL，转移至样本处理区。

4.1.2.2  加样（样本处理区进行）：

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4.1.1.7中制备的RNA溶液各10 mL，盖紧管盖，500 r/min离心30 s。（阳性对照不需要提取核酸，可以直接吹打混匀后吸取当模板）

4.1.2.3  荧光 RT-PCR 检测（在检测区进行）：

将4.1.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：

第一阶段，反转录 42℃/30 min； 第二阶段，预变性 94℃/2 min；

第三阶段，94℃ /15sec，55℃/10 sec, 60℃/30 sec 共 40 个循环.。荧光收集在第三阶段每

次循环的 60℃延伸时进行。

试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

4.2  结果判定

4.2.1  结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光 PCR 仪，选定 FAM(465-510)检测通道读取检测结果， ABI 仪器选择 5’FAM; 3’TAMRA 淬灭基团。

4.2.2 质控标准

a)  阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。

b)  阳性对照的 Ct 值应小于等于 30，并出现典型的扩增曲线。

c)  如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

4.2.3 结果判定

a)  阴性：无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。

b)  阳性：Ct 值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性，含有马流感病毒核酸。

【注意事项】

1.  实验室应至少分三个区：样品处理区、反应混合物配制区和检测区。

2.  各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。

3.  分装反应液时，应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

4.  阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡 1～2 秒。

5.  试剂盒中各组分应避免反复冻融。

【规格】  50 份/盒

 【贮藏与有效期】荧光 RT-PCR 检测试剂盒-20℃保存，有效期为 12 个月；《病毒基因组 DNA/RNA 离心柱型提取试剂盒》室温保存。