犬冠状病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品名称：犬冠状病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Canine Corona Virus (CCoV) Probe qRT-PCR Kit

犬冠状病毒(Canine Corona Virus，CCoV )为单链 RNA 病毒，有 6-7 种多肽，其中 4 种是糖肽，不含 RNA 聚合酶及神经氨酸酶。可使犬发生程度不同的胃肠炎症状，特征有频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。本病一年四季均可发生，以冬季多发，病犬是主要的传染原，犬可通过呼吸道、消化道、粪便及污  染物传染。该病一但发生，同窝犬同室犬很难控制均可造成感染。幼犬死亡率较  高,对幼犬的危害较大。最近的研究发现 CCoV 感染的宿主范围有不断扩大的趋势,许多野生动物如虎、狮、大熊猫、小熊猫、水紹也可感染。本产品就是以探针  法荧光定量RT-PCR 技术为基础开发的专门检测犬冠状病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1.       即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.       引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.       提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.       特异性高，引物是根据犬冠状病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5.       本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6.       本产品只能用于科研。

【试剂组成】

【自备试剂】样品 RNA。

【注意事项】

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能

1.    污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.    用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.    在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.    换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.    换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.    重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.    如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.    用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。

Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.    在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设  置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好  后最后加）：

五、数据处理

12.  如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 C 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13.  如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 C

值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。