人类白细胞抗原A基因染料法PCR试剂盒

产品名称：人类白细胞抗原A基因染料法PCR试剂盒

英文名称：Human Leukocyte Antigen-A(HLA-A)SYBR qPCR Kit

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人类的主要组织相容性复合体（MHC）的表达产物，该系统是目前所知人体最复杂的多态系统。 根据基因产物的结构，功能，细胞分布等因素，将 HLA 基因分成了 3 大类，其中 HLA-I 型基因，包括了 HLA-A，HLA-B，HLA-C 等经典的抗原基因。本产品就是以荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测 HLA-A 基因的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据 HLA-A 基因高度保守区设计,不会扩增其他基因。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6.本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。

【试剂组成】

【自备试剂】样品 RNA。

【注意事项】

一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8.如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送1ml免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。

10.在标记管中按下表加入各成分：

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX，则用水替代。

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

五、数据处理

12.     设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13.     如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14.     如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。