新型布尼亚病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品名称：新型布尼亚病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Novel Bunyavirus Probe qRT-PCR Kit

新型布尼亚病毒，卫生部门从蜱虫中毒者体内分离出的病毒。或将被认定为一种新型病毒。从目前来看，这一病毒主要由蜱传播，且可以治疗，病死率很低。目前未发现人传染人的病例。布尼亚病毒自然感染见于许多脊椎动物和节肢动物 (蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，并能在一些哺乳类、鸟类和蚊细胞培养中生长;   对人可引起类似流感或登革热的疾病、出血热(立夫特谷热和克里米亚─刚果出血热等)及脑炎(加利福尼亚脑炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒 3 种传播类型。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测新型布尼亚病毒的试剂盒， 它具有下列特点：

1.    即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.    引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.    提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.    特异性高，引物是根据新型布尼亚病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的

RNA 发生交叉反应。

5.    本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6.    本产品只能用于科研。

【试剂组成】

【自备试剂】

样品 RNA。

【注意事项】

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2.    用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.    在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.    换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.    换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.   重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.    如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳

性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL 阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样， 以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.    用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA/提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.    在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加）：

11.    盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

五、数据处理

12.    如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13.    如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 35，则为阳性。