半胱氨酸（cysteine, Cys）含量测定试剂盒说明书

                                                  微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

蛋白质含有三种含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是唯yi一种含有巯基的含硫氨基酸，从甲硫氨酸转化而来，并且可与胱氨酸互相转化。Cys参与蛋白质二硫键的形成，经常是蛋白质活性中心的组成部分，还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外，Cys大量积聚在皮肤和粘膜表面，在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基，以维持皮肤的正常代谢，调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。

测定原理：

Cys还原磷钨酸生成钨蓝，在600nm处有吸收峰；通过600nm吸光度，计算Cys含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、85％磷酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。用前1天，向试剂三中加2.5mL蒸馏水充分溶解，再加85％磷酸0.625mL，混匀后盖紧（防止水分散失）沸水浴2h；冷却后加10mL蒸馏水，4℃可保存2周。

标准品：粉剂×1瓶，临用前加10 mL蒸馏水，充分溶解。1μmol/mL标准液，4℃避光保存。用不完的试剂4℃可保存3天。

半胱氨酸提取：

1、   液体样品中半胱氨酸提取：取0.1mL液体样品，加试剂一0.9mL，充分混匀，8000g

4℃离心10min，取上清液，待测。

2、   组织中半胱氨酸提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10 min，取上清液待测。

3、   细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到600 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL蒸馏水，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A空白管。

3. 标准管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL标准液，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A标准管。

4. 测定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL上清液，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需要做一次。

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按液体样品的体积计算：

半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

2. 按样本质量计算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）÷W=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

3. 按照蛋白浓度计算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（V样×Cpr）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

4. 按细胞数量计算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

C标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.02mL；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.02 mL；V样总：样品提取液，1mL；W：样品质量，g。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1. 按液体样品的体积计算：

半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

2. 按质量计算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鲜重）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×（V样总÷V样）÷W=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

3. 按照蛋白浓度计算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（V样×Cpr）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

4. 按细胞数量计算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)] ×（V样总÷V样×细胞数量）=1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

C标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.02mL；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.02 mL；V样总：样品提取液，1mL；W：样品质量，g。

注意事项：

最di检出限为100μmol/L。