半胱氨酰亚砜裂解酶(L-cysteine sulfoxide lyase, CSL)试剂盒说明书
微量法100T/48S
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
半胱氨酰亚砜裂解酶(CSL)广泛存在于百合科葱属(如大蒜和洋葱),十字花科芸薹属
(如卷心菜,菜花,西兰花),以及豆科中的合金欢属中,并通常被称为蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶的作用下转化成香菇精,以及产生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是内源性甲醛生成的关键酶之一,测定CSL活性对于研究食品安全具有重要意义。
测定原理:
CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亚砜反应产生丙酮酸,与2,4-er硝/基苯肼反应,在碱性条件下显棕红色,在510nm下有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器:
天平、研钵、离心机、酶标仪、96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,4℃避光保存,临用前加入2mL水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存,临用前加入10mL水溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存;
试剂三:液体15mL×1瓶,4℃保存。
试剂四:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂五:液体30mL×1瓶,4℃保存。
样本处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆,4℃浸提40min。12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定操作:
对照管 | 测定管 | |
样品(μL) | 50 | 50 |
试剂一(μL) | 25 | |
蒸馏水(μL) | 25 | |
试剂二(μL) | 25 | 25 |
充分混匀,37℃反应20min | ||
试剂三(μL) | 100 | 100 |
试剂四(μL) | 50 | 50 |
充分混匀,室温反应5min | ||
试剂五(μL) | 250 | 250 |
充分混匀,静置5min,吸取200μL至96孔板,测定510nm处吸光值,记为A对照和A测定,△A=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。 |
计算公式:
标准曲线:y = 0.7313x + 0.0027,R2 = 0.9993;x为标准品浓度:μmol/mL;y为吸光度△A
1. 按蛋白含量计算
C-S lyase活性(μmol/min/mg prot)=(△A -0.0027)÷ 0.7313×V样÷(V样×Cpr )÷T
=0.068×(△A-0.0027)÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
C-S lyase活性(μmol/min/g 鲜重)=(△A -0.0027)÷ 0.7313×V样÷(V样÷V样总×W )÷T
=0.068×(△A-0.0027)÷ W
V样,加入样本上清体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T,反应时间,20min。
注意事项:
1. 若测定结果中吸光值超过1,请将样本稀释后进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。香菇类样本活性较大,可能需要稀释80-100倍。