谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量测定试剂盒说明书

                                 微量法100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

Glu广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的20种氨基酸之一，而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源之一。此外，Glu还是味精的主要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。

测定原理：

利用专用提取液提取，然后用显色剂进行显色，显色后在570nm下进行测定。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶， 4℃保存；临用前加入5mL蒸馏水充分溶解混匀，用不完的试剂仍 4℃保存。

谷氨酸提取：

1、细菌或培养细胞样品：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）或细胞培养液样品：按照血清（浆）或细胞培养液体积（mL）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或者细胞培养液加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、   在有盖EP管中加入下列试剂：

混匀，90℃水浴20min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，于570nm波长处记录吸光值A。△A=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

谷氨酸含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0074x- 0.5255；x为谷氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白浓度计算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照样本质量计算

谷氨酸含量(µg/g鲜重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=135.1×(△A+0.5255) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(500×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）或细胞培养液体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0037x- 0.5255； x为谷氨酸含量（µg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）或者细胞培养液体积计算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0037×V1]÷(V3×V1÷V2）=2703×(△A+0.5255)

3、按照蛋白浓度计算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(V1×Cpr)=270.3×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照样本质量计算

谷氨酸含量(µg/g鲜重)= [(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.3×(△A+0.5255) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

谷氨酸含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(500×V1÷V2)=0.541×(△A+0.5255)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）或细胞培养液体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注 意：

1、该试剂盒仅适用于发酵液或组织中谷氨酸含量测定，检测下限为100µg/mL。

2、标准曲线线性范围为：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA线性范围为：0.01-1；若大于1则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。