亮氨酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）试剂盒说明书

                                  微量法100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：                           

LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清LAP活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。

测定原理：

LAP分解L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。

自备用品：

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1的比例（建议2000万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

LAP测定步骤：

1、   分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。

2、   将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可50℃水浴加热约30min促进溶解）；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入50μL样本和150μL试剂一，混匀后立即记录405nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：若ΔA大于0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

LAP活力单位的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）LAP活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=205.8×ΔA

2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.103×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）LAP活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=411.5×ΔA

2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷ (V样×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V样÷V样总) ÷T=0.206×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。