鸟氨酸转氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)试剂盒说明书

                                                    微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理：

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和NADH作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生NAD，通过检测340nm处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配制：

提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体30 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加4mL试剂一充分溶解；现配现用。

酶液提取：

1.        组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

2.        细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

3.        液体：直接检测。

测定操作：

1.        酶标仪预热30min，调节波长至340nm。

2.        将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制）

3.        取96孔板，依次加入60μL试剂二，60μL试剂三，60μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2，△A=A1-A2。

4.        计算公式：

用96孔板测定的计算公式如下：

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T

=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g