乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）试剂盒说明书

                                                微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.1）是植物光呼吸代谢中的关键酶，也是光下合成草酸的关键酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。

测定原理：

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加5mL双蒸水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：液体2mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g， 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定操作表：

酶活性计算公式：

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 392×△A÷W

ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 784×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟氧化1nmol乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GO活性（nmol/min /g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 784×△A÷W

ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min