单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性测定试剂盒说明书

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：

MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD⁺，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD⁺没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和双蒸水

试剂组成和配置：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20mL×1瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。临用前加入3 mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体15μL×1瓶，4℃保存。临用前加3 mL试剂二充分溶解。

粗酶液提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.        . 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g ，4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

3.  血清等液体：直接测定。

MDHAR测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL试剂三、20μL试剂四、20μL试剂五和120μL试剂二，最后加入20μL上清液，迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2。

MDHAR活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（Cpr×V样）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 804×△A ÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷V样）÷T

= 804×△A

ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（Cpr×V样）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T

= 1608×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 1608×△A ÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×10⁹÷V样）÷T

=1608×△A

ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的4℃保存，3天内使用完。