维生素B1（Vitamin B1，VB1）试剂盒说明书

 微量法100T/96S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理：

VB1在碱性条件下还原铁氰hua钾生成亚铁氰hua钾，亚铁氰hua钾与Fe³⁺在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体70mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体2mL×1支，4℃保存。

试剂三：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理：

1.        组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min）。

2.        细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

3.        血清：直接测定。                  

测定操作：

计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R² = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）

1. 按照蛋白含量计算

VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr

                    = 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V样总）

                = 58.8×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1含量（μg/10⁴ cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V样总）

                     = 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017

                  = 58.8×（△A-0.0031）

V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0085x +0.0031，R² = 0.9991；x为标准品浓度：μg/mL；y为△A（A测定管-A空白管）

1. 按照蛋白含量计算

VB1含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr

                    = 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1含量（μg/g鲜重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V样总）

                = 117.65×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1含量（μg/10⁴ cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（细胞数量÷V样总）

                     = 117.65×（△A-0.0031）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.0085

                  = 117.65×（△A-0.0031）

V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项：

1.        若测定结果中吸光值超过2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.        蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.        显色完成后立即进行测定。

4.        标准曲线线性范围为0.1-10μg/mL。