非洲猪瘟病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

商品名称：非洲猪瘟病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

Name     ：African Swine Fever Virus(ASFV) Probe PCR Kit

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)会引起非洲猪瘟等急性、出血性、烈性传染病，其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热(达40~42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊，对养猪业造成严重损害，因此快速检测非洲猪瘟病毒具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据非洲猪瘟病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的DNA发生交叉反应。

5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6.本产品只能用于科研。

【试剂组成】

【储存条件及有效期】

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

【自备试剂】样品 DNA。

【使用方法】

一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.       标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2.      用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.      在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.      换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.      换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.      重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7.       如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8.      用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA/提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9.      如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。

在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳

10.       性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

11.     盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

四、数据处理

12.      如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

       13.    如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。